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苏州快捷康生物技术有限公司

地址:苏州吴中经济开发区田上江路105号15幢302室

销售:0512-81667002

技术:18013110576

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网址:www.kjkbio.cn

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黄曲霉毒素M1试剂盒

更新:2015/1/19 15:26:04点击:
  • 产品品牌快捷康生物
  • 产品型号kjkB002C
产品介绍

【产品简介】

黄曲霉毒素是一类真菌(如黄曲霉和寄生曲霉)的有毒的代谢产物,它们具有很强的致癌性,主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液,动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉毒素M1(AFM1)的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。薄层色谱一直是检测黄曲霉毒素常用的方法,但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉毒素M1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素M1残留。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法,在微孔条上预包被偶联抗原,样本中的残留物黄曲霉毒素M1和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲霉毒素M1抗体,加入酶标记物后,用TMB底物显色,样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素M1的含量成负相关,与标准曲线比较可得出相应残留物黄曲霉毒素M1的含量。

【试剂盒技术指标】  

规       格:96孔/盒

灵 敏 度: 0.025ppb

检测时间: 75min

样本检测下限:

牛奶……………………………………………0.25ppb

奶粉、奶油、奶酪……………………………0.025ppb

饲料……………………………………………2.5ppb

反应率

黄曲霉毒素M1……………………………………100%

回收率

食    品…………………………………………85±10%

饲    料…………………………………………75±10%

试剂盒组成  

1、     微量测试孔:(1X96孔板)每条8孔,一板12条

1、     标准液X6瓶:(1ml/瓶) 0ppb、0.025ppb、0.1ppb、0.5pp、1ppb、2ppb

2、     酶标记物       12ml…………………………红色帽

3、     抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

4、     底物液 A液    7ml…………………………白色帽

5、     底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

6、     终 止 液          7ml…………………………黄色帽

7、     20X浓缩洗涤液40ml…………………… 透明帽

8、     5X浓缩样品稀释液50 ml…………………蓝色帽

所用仪器、试剂】  

仪          器:微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量

                   0.01g)

微量移液器:单道 20μl~200μl、100μl~1000μl、多道 250μl

试           剂:甲醇、正己烷、滤纸

样本前处理步骤  

处理任何样本时,都必须注意:

(a)实验中必须使用一次性吸头,在吸取不同的试剂时要更换吸头。

(b)实验之前须检查实验器具是否干净,必要时可对实验器具进行清洁,以避免污染干扰实验结果。

样本前处理需配制: 

配液1、样品提取液:70%甲醇溶液30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70%甲醇溶液。

配液2、将5X浓缩样品稀释液用去离子水按照1:4稀释(1 份浓缩样品液+4份去离子水)用于样品的稀释。

(a)生鲜牛奶;

1、直接取50μl牛奶+450μl样品稀释液混合30s;

2、取50μl用于检测检测分析。

          样本稀释倍数:10

b)奶粉、奶油、奶酪

1、称取5g样品于50ml离心管中,加入10ml甲醇,强力振荡5min;室温4000r/min以上,离心10min。

2、取2ml上清液,于50℃水浴中氮气/空气吹干。

3、用1ml正己烷溶解残留物,加入1ml稀释后的样品稀释液混合30s;室温4000r/min以上,离心5min,

4、取50ul下层溶液进行检测分析。

         样本稀释倍数:1

C饲料

1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中,加入10ml 的提取溶液混合;强力振荡5分钟。

2、用Whatman No.1滤纸过滤;收集过滤液。

3、取出上清液50ul与样品稀释液950ul 充分混合30s,取50ul进行检测分析。

          样本稀释倍数:100

酶标免疫分析程序

测定前应须知:

1、     使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温(20-25℃)。

2、     使用之后立即将所有试剂放回2-8℃。

3、     在ELISA分析中的再现性,很大程度上取决于洗板的一致性,正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、     在所有恒温孵育过程中,避免光线照射,用盖板膜封住微孔板。

操作步骤:

1、   将所需试剂从冷藏环境中取出,置室温(20-25℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、   按板架及需要取出微孔条,将不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃。

3、   配液:将40ml浓缩洗涤液(20倍浓缩)用去离子水按照1:19稀释(1份浓缩洗涤液+19份去离子水),或按所需用量配制洗涤

       液。

4、  编号:将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、  标准品/样本50μl/孔到各自的微孔中,然后加抗体50μl/孔,用盖板膜封板,轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

6、  取出将孔内液体甩干,用洗液250μl/孔洗板4-5次,每次间隔15-30秒,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺

       破)。

7、  每孔加入酶标记物100μl,盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干,用洗涤液充分洗,4-5遍(同上),用吸水

       纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

8、   显色:每孔加入A液50μl,再加B液50μl,轻轻振荡混匀,25℃环境中避光显色15min。

9、  测定:每孔加入终止液50μl,轻轻振荡,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据)测定吸光

      度值(OD值)。

结果判定

结果判定有两种方法,粗略判定可用第1种方法,定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与黄曲霉毒素M1的含量成负相关。

1、粗略判定:

用样本的平均吸光度值与标准吸光度值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本1的吸光度值为0.350, 样本2的吸光度值为0.890,标准液吸光度值分别是:0ppb为1.810;0.025ppb为1.550;0.1ppb为1.030;0.5ppb为0.580; 2ppb为0.211。则样本1的浓度范围是0.5ppb-2ppb; 样本2的浓度范围是0.1 ppb-0.5 ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素M1的实际含量。

2、定量判定:

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

百分吸光度值(%)=

B

×100%

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B00ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标,以黄曲霉毒素M1标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素M1实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准曲线:

B/B0 (%)

黄曲霉毒素M1试剂盒回归曲线   

      0.025         0.1          0.5           2 

黄曲霉毒素M1(ppb) [μg/kg]

图1:黄曲霉毒素M1检测试剂盒的回归曲线

4、再现性:

%CV

           黄曲霉毒素M1试剂盒精密度

      0         0.025    0.1     0.5       2 

黄曲霉毒素M1 (ppb) [μg/kg]

2:黄曲霉毒素M1检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度,图2显示出黄曲霉毒素M1检测试剂盒的精密度情况,获得的标准吸收值的变异系数(%CV)对相应黄曲霉毒素M1浓度作曲线,可以看到在全部范围内变异系数如此之低,可以得到很好的再现性。

注意事项

1、    使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。

2、    在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会伴随着出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行

        下一步操作。

3、    混合要均匀,否则会出现重复性不好的现象。

4、    反应终止液为2M硫酸,避免接触皮肤。

5、    不要使用过了有效日期的试剂盒,稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、    不用的微孔板放进自封袋密封;标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。

7、    显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位(A450nm< 0.5 )时,表示试剂可能变质。

8、    该试剂盒最佳反应温度为25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

 原包装应储存于28℃保鲜冷藏,切勿冷冻。

【有效期】

 有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。

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