孔雀石绿试剂盒

【产品简介】

孔雀石绿因有非常好的抗菌作用和药动力学的特性，曾经被广泛应用，残留危害人类健康，现已禁用。

孔雀石绿快速检测试剂盒具有方便、快速、灵敏等特点，适用于动物组织（水产、鸡、猪、牛）、牛奶、饲料等大批量样品中的孔雀石绿快速检测。

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物孔雀石绿和微孔条上预包被的偶联抗原竞争孔雀石绿抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物孔雀石绿的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物孔雀石绿的含量。

【试剂盒技术指标】  

规       格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.05ppb

检测时间： 75min

样本检测下限：

组织\水样…………………………………………0.5ppb

参考标准GB/T 20361-2006检测下限为0.5ppb

交叉反应率：

显性孔雀石绿……………………………………100%

回收率：

组织……………………………………………75±10%

水样 ……………………………………………80±10%

【试剂盒组成】  

1、      微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、      标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、      酶标记物       12ml…………………………红色帽

4、      抗体工作液     7ml…………………………绿色帽

5、      底物液 A液    7ml…………………………棕色帽

6、      底物液 B液    7ml…………………………黑色帽

7、      终 止 液          7ml…………………………黄色帽

8、      20X浓缩洗涤液40ml…………………… 白色帽

9、      2X浓缩样品稀释液50 ml…………………蓝色帽

10、   试剂A  10 ml………………………………黑色帽

【实验前溶液配制】

 配液1、样品提取液的配制取1 ml试剂A 与99 ml乙氰混合均匀，用于样本提取，

 配液2、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1 份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样本的复溶。

 配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按 所需用量配制洗涤

           液。

【所用仪器、试剂】  

仪        器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平

               （感量0.01g ）

微量移液器：单道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

试            剂：乙腈、中性氧化铝

【样本前处理步骤】  

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验前须检查各种实验器具是否干净，必要时对实验器具进行清洁，避免污染干扰实验结果。   

样本处理方法

（a）组织样品处理方法：

1、 称取5±0.05g组织样品于50ml离心管中，加入10ml样品提取液，充分震荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；

2、 取6ml上清液于另一干净玻璃管中，加入3g中性氧化铝；震荡2min ，静止10min；

3、 取2ml上清液于玻璃管中，在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥；

4、 加入1ml样品稀释液，充分溶解干燥残留物。

5、 取50 μl上清液与450μl样品稀释液混合30s；

6、 取50ul进行分析。

        样本稀释倍数： 10倍

（b）水样品处理方法：

1、取50ul 上清液与450ul 样品稀释液充分混合30s，

2、取50ul进行分析。

      样本稀释倍数：10倍

【酶标免疫分析程序】

操作步骤：

1、 从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室 温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、 取出框架及需要数量的微孔，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、 加标准品或样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50μl/孔，用盖板膜封板，轻轻振荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、 取出将孔内液体甩干，用洗液250μl /孔，洗板4－5次，每次间隔15-30s，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪

      头刺破）。

6、 每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。重复步骤5洗板。

7、显色：每孔加入底物液A液50μl， 再加B液50μl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

8、 测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数据），

      测定每孔OD值。

【结果判定】

结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与孔雀石绿的含量成负相关。

1、粗略判定：

    用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1 的吸光度值为0.310，样本2 的吸光度值为1.051，标准液吸光度值分别是：0ppb 为2.243； 0.05ppb 为1.816；0.15ppb 为1.415；0.45ppb 为0.74；1 .35ppb 为0.343；4 .05ppb 为0.155。则样本1 的浓度范围是1.35ppb～4.05ppb；样本2的浓度范围是0.15ppb～0.45ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿的实际含量。

2、定量判定：

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

百分吸光度值（%）＝	B	×100%
	B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标，以孔雀石绿标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中孔雀石绿实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。

3、标准曲线：

B/B0 (%)

 

        0.05           0.15         0.45            1.35          4.05

                 孔雀石绿(ppb) [μg/kg]

            图1：孔雀石绿检测试剂盒的回归曲线

4、再现性：

%CV

      

             孔雀石绿 (ppb) [μg/kg]

         图2：孔雀石绿检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出孔雀石绿检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应孔雀石绿浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】

1、 使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、 在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下

     一步操作。

3、 混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、 反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、 不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、 不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、 显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、 该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

 原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

 有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。