头孢类（三合一）试剂盒

一、概要

头孢类药物是一种广谱的抗生素，具有优良的抗菌活性和药动学特点，对许多革兰氏阳性和革兰氏阴性及产β-内酰胺酶的细菌有效。头孢类药物是采用破坏细菌细胞壁的方式杀死细菌。由于目前使用的检测分析法样本前处理及测定操作繁琐且费用较高，使推广应用受到限制。

本试剂盒是应用 ELISA 技术研发的新一代药物残留检测产品，操作时间仅需 1.5 小时，能最大限度地减少操作误差和工作强度。

二、试验原理

本试剂盒采用间接竞争 ELISA 方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟和酶标板微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗三者的抗体，加入酶标二抗后，用 TMB 底物显色，样本吸光度值与其所含残留物头孢类药物的含量成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样本中头孢类药物的残留量。

三、适用范围

可定性、定量检测动物组织（肌肉、水产）和牛奶样本中头孢噻呋、头孢曲松、头孢噻肟的残留量。

四、交叉反应率

头孢噻呋 ……………………………………………100%

头孢曲松………………………………………………130%

头孢噻肟……………………………………………73%

头孢唑啉…………………………………………小于 0.1%

五、使用单位需自备的设备及试剂

设备：

┅┅微孔板酶标仪           450/630nm

┅┅旋转蒸发仪/氮气吹干装置

┅┅振荡器

┅┅涡旋仪

┅┅离心机

┅┅天平：感量  0.01g

┅┅刻度移液管：10ml

┅┅洗耳球

┅┅容量瓶：500ml

┅┅聚苯乙烯离心管：  2ml、50ml

┅┅微量移液器：单道     20～200μl、100～1000μl、多道 250μl

试剂：

----浓盐酸（分析纯）

----乙腈(分析纯)

----正已烷(分析纯)

----去离子水

六、提供的材料与试剂

1、96 孔酶标板×1 块 （包被有偶联抗原）

2、标准品×6 瓶：（1ml/瓶）0ppb，0.5ppb，1.5ppb，4.5ppb，13.5ppb，40.5ppb

3、高浓度标准品：（1ml/瓶） 1ppm：

4、酶标二抗             12ml…………………红色帽   

5、抗体工作液           7ml…………………绿色帽

6、底物液 A 液          7ml…………………白色帽

7、底物液 B 液          7ml…………………红色帽

8、终 止 液               7ml…………………黄色帽

9、20×浓缩洗涤液    40ml…………………透明帽

10、2×浓缩复溶液    50ml…………………蓝色帽

七、溶液的配制

配液 1: 0.05 M 盐酸溶液量取 2.1ml 浓盐酸加入去离子水中定容至500ml，混匀。

配液 2: 提取工作液量取 80ml 乙腈加入 20ml 0.05M 盐酸中，混匀。

配液 3: 复溶工作液用去离子水将 2×浓缩复溶液按 1：1 体积比进行稀释（1 份 2×浓缩复溶液+1 份去离子水）用于样本的复溶，复溶工作液在 4℃（39.2℉）环境可保存一个月。

配液 4: 洗涤工作液用去离子水将 20×浓缩洗涤液按 1：19 体积比进行稀释（1 份 20×浓缩洗涤液+19 份去离子水用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在 4℃（39.2℉）

环境可保存一个月。

八、样本前处理步骤

样本处理前须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（b）实验之前须检查各种实验器具是否洁净，必须使用洁净实验器具，以避免污染干扰实验结果。

（c）未处理的样本需冷冻环境保存。

（d）处理好的样本应立即用于检测，不易保存。

（一）动物组织（鸡肉、猪肉、牛肉、鱼、虾）样本前处理方法

-----称取 2.0±0.05g均质后的组织样本至 50ml 聚苯乙烯离心管中，加入 8ml 提取工作液（见配液 2），用振荡器振荡 5min，3000g离心 5min；

----移取 1ml 上清至 10ml 洁净干燥玻璃试管中， 50-60℃于（122-140℉）水浴氮气流下吹干；

----加入 1ml 正己烷，用涡旋仪涡动 30s 溶解干燥残留物，再加入 1ml 复溶工作液（见配液 3）用涡旋仪涡动 30s，3000g离心 5min；

-----除去上层有机相，取下层水相 50μl 用于分析。

（二）牛奶样本处理方法

----移取 100μl 鲜牛奶至 2ml 离心管中，再加入 900μl 复溶工作液（见配液 3），混匀。

----取 50μl 用于分析。

九、检测步骤

测定前应须知：

1、使用之前将模具内所有试剂与酶标板放实验桌回温至室温（20-25℃/68-77℉）。

2、使用之后立即将所有试剂放回 2-8℃(36-46℉)。

3、在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是 ELISA 测定程序中的要点。

4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

操作步骤：

1、将所需试剂从冷藏环境中取出，按照上述方法进行回温，注意每种液体试剂使用前均需摇匀。

2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放回铝箔袋重新真空密封，保存于 2-8℃（36-46℉）环境中。

3、浓缩洗涤液和浓缩复溶液使用前也需按上述方法回温。

4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做 2 孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、加标准品/样本和抗体工作液：加标准品/样本 50μl 到对应的微孔中，然后加入抗体工作液 50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置 4-8℃（36-46℉）避光环境中反应 30min。

6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液（见配液 4）250μl/孔，充分洗涤 4－5 次，每次间隔 10s，泼掉板孔内洗涤液，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破）。

7、加酶标二抗：加入酶标二抗 100μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃（77℉）避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤 6。

8、显色：加入底物液 A 液 50μl/孔，再加入底物液 B 液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后，25℃置（77℉）环境中反应 15min（见注意事项 8）。

9、测定：加入终止液 50μl/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm 处（建议用双波长 450/630nm 检测，请在5min 内读完数据），测定每孔 OD 值。(若无酶标仪，则不加终止液用目测法可进行判定)。

十、结果判定

结果判定有两种方法,粗略判定可用第 1 种方法，定量判定用第 2 种方法。注意样本吸光度值与其所含头孢三合一的含量成负相关。

1、用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ppb)。假设样本 1 的吸光度值为 0.110， 样本 2 的吸光度值为 0.820， 标准品吸光度值分别是：0ppb 为1.880；0.5ppb 为 1.360；1.5ppb 为 0.986；4.5ppb 为 0.509；13.5ppb 为 0.190；40.5ppb 为 0.079。则样本 1 的浓度范围是 13.5ppb-40.5ppb 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中头孢类药物残留的浓度范围；样本 2 的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中头孢类药物残留的浓度范围。

2、定量分析

（1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准品（0 标准）的吸光度值的平均值，再乘以 100%，

即百分吸光率（%）＝B/ B0 ×100%

B—标准品或样本溶液的平均吸光度值

B0—0ppb 标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以头孢三合一标准品浓度（ppb）的对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中头孢三合一的实际浓度。若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

十一、检测方法灵敏度、准确度、精密度

试剂盒灵敏度：0.5ppb

样本最低检测限：

动物组织………………………………………2ppb

牛 奶 …… …… … …… …… … …… …… …… … …5 p p b

准确度：

动物组织（鸡肉、猪肉、牛肉）………75% ±10%

动物组织（鱼 、虾）……………………… 70%±1 0%

牛奶 …………………………………… 90% ±10%

精密度：

试剂盒的板内、板间变异系数均小于 10%。

十二、注意事项

1、室温低于20℃（68℉）或试剂及样本的温度没有回到室温（20-25℃/68-77℉）会导致所有标准的 OD 值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

3、每加一种试剂前需将其摇匀。

4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、不要使用超出有效期的试剂盒；也不要使用超出有效期的试剂盒中的任何试剂，掺杂使用超出有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

6、储存条件保存试剂盒于 2-8℃（36-46℉），不要冷冻，将不用的微孔板放回铝箔袋重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0 标准的吸光度（450/630nm）值小于 0.5 （A450nm<0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、在加入底物液 A 液和底物液 B 液后，一般显色时间为15min 即可。若颜色较浅，可延长反应时间到 20min（或更长），但不得超过 25min。反之，则减短反应时间。

十三、贮藏条件及保存期

贮藏条件：保存试剂盒于2~8℃（36-46℉）环境中。

保 存 期：有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。