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苏州快捷康生物技术有限公司

地址:苏州吴中经济开发区田上江路105号15幢302室

销售:0512-81667002

技术:18013110576

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网址:www.kjkbio.cn

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三聚氰胺试剂盒

更新:2015/1/19 15:25:47点击:
  • 产品品牌快捷康生物
  • 产品型号kjkB0027B
产品介绍

【测定原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法检测牛奶和水产等样本中的三聚氰胺,在微孔条上预包被上偶联抗原,利用抗原与抗体的特异性免疫化学反应的原理来进行,样本中的三聚氰胺和微孔条上预包被偶联抗原竞争抗三聚氰胺抗体,加入酶标记物后,用TMB底物显色,样品中的三聚氰胺含量与样品的吸光度值呈反比,与标准曲线比较即可得出三聚氰胺含量。

【试剂盒技术指标】  

规       格:96孔/盒

灵 敏 度: 1ppb

检测时间: 75min

样本检测下限:

奶粉………………………………………………20 ppb

牛奶………………………………………………16 ppb

牛奶/奶 粉(处理法二)………………………  1 ppb

组织(鸡/猪/鸭/鱼/虾/肝脏)……………………2 ppb

饲   料  …………………………………………100 ppb

蛋   类   …………………………………………20 ppb

血   清  …………………………………………  4 ppb

交叉反应率

三聚氰胺  …………………………………………100%

三聚氰酸……………………………………………60%

三   嗪  ……………………………………………< 1%

三嗪二铵…………………………………………< 1%

回收率

牛奶/奶 粉  ……………………………………90±15%

组    织  …………………………… 85±10%

饲    料  …………………………… 85±10%

蛋    类  …………………………… 80±10%

试剂盒组成  

1、    微量测试孔:1×96孔板(12条×8孔)

2、    标准液X6瓶:(1ml/瓶)0ppb、1ppb、3ppb、9ppb、27ppb、81ppb

3、    酶标记物    12ml………………… 红色帽

4、    抗体工作液  7ml………………… 绿色帽

5、    底物A液     7 ml………………… 棕色帽

6、    底物B液     7 ml …………………黑色帽

7、    终止液      7 ml …………………黄色帽

8、    20X浓缩洗涤液40 ml……………白色帽

9、    2X浓缩复溶液 50 ml ……………蓝色帽

所用仪器、试剂  

具备的仪器:微孔板、酶标仪、匀质器、振荡器、离心机、刻度移液管、天平(感量0.01g)

微量移液器:单道 20ul~200ul、100ul~1000ul

多道 250 ul

试     剂:乙腈、氢氧化钠 、浓盐酸、去离子水、正己烷、甲醇

【实验前溶液配制】

配液1、将2X浓缩复溶液用去离子水按照1:1稀释(1 份浓缩复溶液+1份去离子水)用于样本的复溶。

配液2、将40ml浓缩洗涤液(20倍浓缩)用去离子水按照1:19稀释(1份浓缩洗涤液+19份去离子水),或按 所需用量配制洗涤液。

配液3   1M HCl 溶液取8.6ml浓HCl加去离子水定容至100ml。

配液4   1M NaOH 溶液称取4g NaOH加去离子水定容至100ml。

配液5   0.1M NaOH 溶液称取0.4g NaOH加去离子水定容100ml。

配液6   乙腈-0.1M NaOH溶液84ml乙腈和16ml0.1MNaOH混合均匀。

样本前处理步骤  

样本处理前须知

处理任何样本时,都必须注意:

(a)本试剂盒所检测的组织样本包括:动物组织、禽类和水产组织。eg:鸡、鸭、猪、牛、羊、兔、鱼、虾等。

(b)实验中必须使用一次性吸头,在吸取不同的试剂时要更换吸头。

(c)实验之前须检查各种实验器具是否干净,必要时可对实验器具进行清洁,以避免污染干扰实验结果。

样本处理方法

a)牛奶专用样本处理方法:

1、取牛奶样本600μl到2ml的离心管中,加入1ml乙腈,充分振荡混匀;4000r/min以上离心5min;

2、取100μl上清液,再加入500μl复溶液(见配液1),混匀;

3、取50μl用于分析。

        样本稀释倍数:16倍

b)奶粉专用样本处理方法:

1、称取2.0±0.05g奶粉样本至50ml离心管中,加入4ml甲醇,充分振荡;

2、15℃4000r/min以上离心10min,取100μl上清液,再加入900μl复溶液(见配液1),混匀;取50μl用于分析。

          样本稀释倍数:20倍

c)饲料样品处理方法:

1、将饲料样品研碎,称2.0±0.05g研碎的饲料样品,加入2ml1MHCl,加入16ml去离子水均质。

2、旋流1min,放振荡器上振荡2min15℃4000r/min以上离心15min,取出10ml上清液并用1MNaOH将pH值调至6-8。(注:因饲

     料样品的不同,加入1MNaOH的量有所差异,根据情况调节,一般加入范围是0.5ml—1ml之间)。

3、15℃,4000r/min以上离心15min,吸出上清液。(如果上清仍然浑浊可提高转速或用滤纸过滤)。

4、用稀释后的复溶液10倍稀释上清液(取100μl上清液加入900μl稀释后的复溶液,并且混合均匀,混合30s)。

5、取50μl进行分析

      样本稀释倍数:100倍

d)牛奶/奶粉样本处理方法(处理法二)

1、取2ml奶样或2g奶粉至离心管中;加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振荡2min,15℃4000r/min以上离心10min,取4ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥;

2、用1ml正己烷溶解干燥的残留物后,再加入1ml稀释后的复溶液混合30s,离心去除上层正己烷相;

3、取50μl用于分析。

样本稀释倍数:1倍    定量下限定为:2ppb

e)组织(鸡/////肝脏)样本处理方法:

1、取2.0±0.05g均匀组织样本于50ml离心管中;加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振荡2min,15℃4000r/min以上离心10min,取2ml

    上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥;

2、用1ml正己烷溶解干燥的残留物后,再加入1ml稀释后的复溶液混合30s,离心去除上层正己烷相;

3、取50μl用于分析。

       样本稀释倍数:2 倍   

f)蛋类样本处理方法:

1、用均质器低速均匀样本(蛋清、蛋黄或全蛋)称取2.0±0.05g均质过的样本,加入8ml乙腈-0.1MNaOH充分振荡2min;(注:蛋 清含蛋白成份高,加入提取液后会形成一团胶状物,较蛋黄或全蛋难易摇匀,此情况为正常现象不影响实验结果)15℃, 4000r/min以上离心10min,取1ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干燥;

2、用1ml正己烷溶解干燥的残留物后,再加入1ml稀释后的复溶液混合30s,离心去除上层正己烷相;

3、取下层相用稀释好的复溶液按1:3 (50μl样本液加150μl稀释后的复溶液)稀释,混合30s;

4、取50μl用于分析。

        样本稀释倍数:20倍

g)血清样本处理方法:

1、取0.5ml血清样本于50ml离心管中;

2、加入2ml乙腈-0.1MNaOH充分振荡2min,15℃4000r/min以上离心10min,取1ml上清液在56℃条件下氮气或空气流吹至完全干

     燥;

3、用1ml正己烷溶解干燥的残留物后,再加入1ml稀释后的复溶液混合30s,离心去除上层正己烷相;

4、取50μl用于分析。

样本稀释倍数:4 倍

酶标免疫分析程序  

1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂,置室温(20-25℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、取出需要数量的微孔及框架,将不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃。

3、编号:将样本和标准品对应微孔按序编号,每个样本和标准品做2孔平行,并记录标准孔和样本孔所在的位置。

4、加标准品/样本 50μl/孔到各自的微孔中,然后加抗体50μl/孔,用盖板膜封板,轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

5、取出将孔内液体甩干,用洗液250μl/孔洗板4-5次,每次间隔15-30秒,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

6、每孔加入酶标记物100μl,盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干,用洗涤液充分洗,4-5遍(同上),用吸水

     纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破)。

7、显色:每孔加入底物A液50μl,再加底物B液50μl,轻轻振荡混匀,25℃环境中避光显色15min。

8、测定:每孔加入终止液50μl,轻轻振荡混匀,设定酶标仪于450nm处(建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据),测

     定每孔OD值。

结果判定  

 结果判定有两种方法,粗略判定可用第1种方法,定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与三聚氰胺的含量成负相关。

1、粗略判定:

    用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng/ml)。假设样本1的吸光度值为0.3,样本2的吸光度值为1.0,标准液吸光度值分别是:0ppb2.2431ppb1.8163ppb1.4159ppb0.7427ppb0.31381ppb0.155。则样本1的浓度范围是27ppb-81ppb; 样本2的浓度范围是3ppb-9ppb,乘以其对应的稀释倍数即为样本中三聚氰胺实际浓度。

2、定量判定:

所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值(B)除以第一个标准(0标准)的吸光度值(B0)再乘以100%,即百分吸光度值。

百分吸光度值(%)=

B

×100%

B0

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B00ng/ml标准溶液的平均吸光度值

以标准品百分吸光率为纵坐标,以三聚氰胺标准品浓度(ng/ml)的半对数为横坐标,绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中,从标准曲线上读出样本所对应的浓度,乘以其对应的稀释倍数即为样本中三聚氰胺实际浓度。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算,更便于大

量样品的准确、快速分析。

3、标准曲线:

B/B0 (%)

三聚氰胺试剂盒回归曲线

         1                 3                9               27               81

 (ppb) [μg/kg]

图1:三聚氰胺检测试剂盒的回归曲线

4、再现性:

%CV

       三聚氰胺试剂盒精密度

                 0        1          3         9          27        81

(ppb) [μg/kg]

2:三聚氰胺检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度,图2显示出三聚氰胺检测试剂盒的精密度情况,获得的标准吸收值的变异系数(%CV)对相应三聚氰胺浓度作曲线,可以看到在全部范围内变异系数如此之低,可以得到很好的再现性。

注意事项  

1、使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温(20-25℃)会导致所有标准的OD值偏低。

2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况,则会伴随着出现标准曲线不成线性,重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一

     步操作。

3、混合要均匀,否则会出现重复性不好的现象。

4、反应终止液为2M硫酸,避免接触皮肤。

5、不要使用过了有效日期的试剂盒,稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、不用的微孔板放进自封袋密封;标准物质和无色的发色剂对光敏感,因此要避免直接暴露在光线下。

7、显色液若有任何颜色表明变质,应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位(A450nm< 0.5 )时,表示试剂可能变质。

8、该试剂盒最佳反应温度为25℃,温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

 原包装应储存于2~8℃保鲜冷藏,切勿冷冻。

【有效期】

 有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。
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