玉米赤霉烯酮试剂盒

【原理】

本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物玉米赤霉烯酮与微孔条上预包被的偶联抗原竞争其抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含玉米赤霉烯酮的含量成负相关，与标准曲线比较即可得出残留物玉米赤霉烯酮的含量。

【试剂盒技术指标】  

规      格：96孔/盒

灵 敏 度： 0.5ppb

检测时间： 75min

样本检测下限：

饲    料（谷物、豆类）…………………………50ppb

样本回收率

饲    料（谷物、豆类）……………………80% ±10%

试 剂 盒 组 成

1、微量测试孔：每条8孔，一板12条

2、标 准 液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、 0.5ppb、

     1.5ppb、4.5ppb、 13.5ppb、 40.5ppb

3、酶标记物     12ml  …………………………… 红色帽

4、抗体工作液  7ml ……………………………… 绿色帽

5、底物A液      7ml ………………………………白色帽

6、底物B液  　 7 ml………………………………黑色帽

7、终止液       7 ml ………………………………黄色帽

8、5X浓缩复溶液  50 ml…………………………蓝色帽

9、20X浓缩洗涤液 40 ml……………………… 透明帽

【所用仪器、试剂】  

具备的仪器：微孔酶标仪、打印机、均质器 、氮气吹干装置、振荡器、离心机、刻度移液管、天平（感量

                  0.01g）

微量移液器：单道20μl-200μl，100μl-1000μl、多 道250μl，WhatmanＮｏ１或相当的滤纸

试         剂：甲醇

【样本前处理步骤】  

样本前处理须知

处理任何样本时，都必须注意：

（a）标准液含有玉米赤霉烯酮毒素，应特别小心，使用过的玻璃容器及玉米赤霉烯酮溶液最好用pH7的次氯酸溶液（10%V/V）浸泡过夜。

（b）实验中必须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头。

（c）实验之前须检查各种实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。

样本前处理需配制：

配液1、70%甲醇溶液：30ml蒸馏水或去离子水和70ml纯甲醇混合制备70％甲醇溶液。

配液2、样本复溶液：将5×浓缩复溶液用去离子水以1：4稀释（1 份浓缩复溶液+1份去离子水），用于样本提取后的复溶。

（a ）饲料（谷物、豆类）

1、称取1g粉碎的有代表性的样品于离心管中，加入10ml 70%甲醇溶液混合；强力振荡3分钟。

2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。

3、取出上清液50ul与样本稀释液450ul 充分混合30s取50ul进行分析。

        样本稀释倍数:100

【酶标免疫分析程序】  

测定前应须知：

1、使用之前将所有试剂和需用板条的温度回升至室温（20-25℃）。

2、使用之后立即将所有试剂放回2-8℃环境。

3、在ELISA分析中的再现性，很大程度上取决于洗板的一致性，正确的洗板操作是ELISA测定程序中的要点。

4、在所有恒温孵育过程中，避免光线照射，用盖板膜封住微孔板。

操作步骤：

1、   将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。

2、   按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、   配液：将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤

       液。

4、  编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。

5、  加标准品/样本50μl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50μl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。

6、  取出将孔内液体甩干，用洗液250μl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺

       破）。

7、  每孔加入酶标记物100μl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水

       纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。

8、   显色：每孔加入A液50μl，再加B液50μl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。

9、   测定：每孔加入终止液50μl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸

        光度值（OD值）。

  【结果判定】  

   结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法， 定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与玉米赤霉烯酮的含量成负相关。

1、 粗略判定

      用样本的平均吸光度值与标准值比较即可得出其浓度范围(ng /ml)。假设样本1的吸光度值0.241，样本2的吸光度值为0.785，标准液吸光度值分别是：0ppb为2.260；0.5ppb为1.640；1.5ppb为1.234；4.5ppb为0.680； 13.5ppb为0.348；40.5ppb为0.125。则样本1的浓度范围是13.5ppb-40.5ppb；样本2的浓度范围是1.5ppb-4.5ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中玉米赤霉烯酮实际含量。

2、 定量分析

           （1）百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值

（2）标准曲线的绘制与计算

以标准品百分吸光率为纵坐标，以玉米赤霉烯酮浓度（ng /ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中玉米赤霉烯酮实际含量。

若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样本的准确、快速分析。（欢迎来电索取）

3、  标准曲线：

B/B0 (%)

   

     0.5               1.5             4.5             13.5           40.5

 (ppb) [μg/kg]

图1：玉米赤霉烯酮检测试剂盒的回归曲线

 

4、再现性：

    %CV

     

              0        0.5      1.5      4.5      13.5      40.5

(ppb) [μg/kg]

图2：玉米赤霉烯酮检测试剂盒的精密度

由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出玉米赤霉烯酮检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应玉米赤霉烯酮浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。

【注意事项】  

1、    使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。

2、    在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行

         下一步操作。

3、    混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。

4、    反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。

5、    不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。

6、    不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

7、    显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A_450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。

8、    该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。

【储存】

 原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。

【有效期】

 有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。